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用熒光素、同位素或酶標記抗體或抗原，用于抗原或抗體檢測是目前廣泛應(yīng)用的敏感、可靠的方法。上述三種常用的標記物與抗原或抗體化學(xué)連接之后不改變后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位檢測。

1．免疫熒光技術(shù)　免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence techni）是用化學(xué)方法使熒光素標記的抗體（或抗原）與組織或細胞中的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，進行定性定位檢查抗原或抗體的方法。

（1）直接熒光法：把熒光抗體加到待檢的細胞懸液，細胞涂片或組織切片上進行染色，經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的熒光抗體，將待檢標本在熒光顯微鏡下觀察，有熒光的部位即有相應(yīng)抗原存在，此法可用于病毒感染細胞、帶某種特異抗原的細胞（如T細胞和B細胞）或病原菌的檢查，也可用于組織中沉著的免疫復(fù)合物的檢查。本法的缺點是檢查多種抗原，就需分別制備相應(yīng)的多種標記抗體。

（2）間接熒光法：可克服直接法需制備多種熒光抗體的復(fù)雜操作。將組織或細胞上的抗原直接與相應(yīng)抗體（不標記熒光）結(jié)合，此為*抗體，再把能與*抗體特異結(jié)合的熒光標記的抗免疫球蛋白抗體加入，此為熒光標記的第二抗體，觀察結(jié)果與直接法相同。間接法比直接法敏感性高，如果用于檢查抗原的*抗體是人或動物的只需制備一種抗人或動物的免疫球蛋白熒光抗體。

免疫熒光技術(shù)在傳染病診斷上有廣泛的用途，如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病，檢查抗原或抗體，如查出IgM抗體，可做為近期接觸抗原的標志，所以使用熒光標記抗IgM可診斷近期感染。除微生物學(xué)方面的應(yīng)用外，還可利用單克隆抗體鑒定淋巴細胞的亞類。使用流式細胞儀（fluorescene-activated cell sorting,FACS），能自動檢測細胞的大小、熒光強度。針對細胞表面不同抗原，可以使用兩種不同的熒光染料，如用異硫氰熒光素（FITC）發(fā)黃綠熒光，用羅丹明（TMRITC）發(fā)紅色熒光。由于熒光顏色不同標記兩種不同的抗體，對同一細胞進行雙標記染色。對淋巴細胞亞類鑒定起著巨大推動作用。應(yīng)用間接熒光法也用于自身免疫病的抗核抗體檢查。

2．放射免疫分析法 放射免疫分析法（radioimmunoassay RIA）應(yīng)用競爭性結(jié)合的原理，應(yīng)作放射性同素標記抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）結(jié)合，通過測定抗原抗體結(jié)合物的放射活性判斷結(jié)果，本方法可進行超微量分析，敏感性高，可用于測定抗原、抗體、抗原抗體復(fù)合物。本法常用的同位素有125Ⅰ和131Ⅰ。

放射免疫分析常用的有液相法和固相法兩種：（1）液相法：將待檢標本（例如含胰島素抗原）與定時的同位素標記的胰島素（抗原）和定時的抗胰島素抗體混合，經(jīng)一定作用時間后，分離收集抗原抗體復(fù)合物及游離的抗原，測定這兩部分的放射活性，計算結(jié)合率。在反應(yīng)系統(tǒng)中，待檢標本的胰島素抗原與同位素標記的胰島素競爭奪戰(zhàn)　性與胰島素抗體結(jié)合。非標記的抗原越多，標記抗原與抗體形成的復(fù)合物越少。非標記抗原含量與標記抗原抗體復(fù)合物的量呈一定的函數(shù)關(guān)系。預(yù)先用標準的非標記抗原作成標準曲線后，即可查出待檢標本中胰島素的含量（2）固相法：將抗原或抗體吸附到固相載體表面，然后加待檢標本，zui后加標記抗體。測定固相載體的放射活性，常用的固相載體有溴化氰（CNBr）海豹化的紙片或聚苯乙烯小管。放射免疫分析法應(yīng)用范圍廣泛，包括多種激素（胰島素、生長激素、甲狀腺素等）維生素、藥物、IgE等。

3．酶聯(lián)免疫分析法 酶聯(lián)免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA）是當前應(yīng)用zui廣泛的免疫檢測方法。本法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結(jié)果，可經(jīng)酶標測定儀作定量分析，敏感度可達ng水平。常用于標記的酶有辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase）、堿性磷酶（alkaline phosphatase）等。它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性。這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標抗體可保存較長時間。目前常用的方法有酶標免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附法。前者測定細胞表面抗原或組織內(nèi)的抗原；后者主要測定可溶性抗原或抗體。本法既沒有放射性污染又不需昂貴的測試儀器，所以較放射免疫分析法更易推廣。　

（1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）:是與上述固相RIA相似的原理，將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進行政區(qū)。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。

（2）夾心法（sandwich assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結(jié)合，洗去未結(jié)合的材料后加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結(jié)合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。

間接法（indirecr ELISA）常用于檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應(yīng)抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經(jīng)加底物顯色后，根據(jù)顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。

（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設(shè)分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復(fù)合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統(tǒng)進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統(tǒng)如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結(jié)合4個生物素分子（biotin）。結(jié)合非常穩(wěn)定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結(jié)合，而不影響后者的生物活性。一個抗體分子可偶聯(lián)90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應(yīng)用生物-酶標親合素系統(tǒng)（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應(yīng)系統(tǒng)，同時借助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應(yīng)系統(tǒng)。

表 1　免疫學(xué)測定方法敏感性比較

測定方法
 敏感性（每升）
 
單向免疫擴散試驗
 ＜1～2mg
 
雙向免疫擴散試驗
 ＜1mg
 
火箭電泳
 ＜0.5mg
 
對流電泳
 ＜0.1mg
 
免疫電泳
 ＜5～10mg
 
凝集試驗
 1μg
 
被動血凝試驗
 1μg
 
血凝抑制試驗
 0.1μg
 
補體結(jié)合試驗
 0.1μg
 
放射免疫分析法
 ＜1pg
 
酶聯(lián)免疫吸附試驗
 ＜1ng
 
定量免疫熒光分析
 ＜1pg