HRP分子中與酶活性無關的糖基被過碘酸鈉氧化為醛基,再與抗體蛋白的氨基形成Schiff堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián),在標記前先用2,4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。酶與抗體的結合反應后,再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的結合物。
(1) 取HRP 5mg溶于0.2mol/L,pH5.6醋酸鹽緩沖液1ml中,加入1%DNFB無水乙醇溶液0.1ml,室溫下輕微攪拌1h;
(2) 加入新鮮配置的0.1mol/L NaIO4 0.5ml,此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色,置4℃放置30min,此時溶液由原棕色變?yōu)槟G色;
(3) 加入2.5%乙二醇1ml, 室溫下輕微攪拌1h,終止反應;
(4) 加入待標記的抗體5-10mg, 用1.0mol/L, pH9.5 CBS,調(diào)節(jié)pH值至9.0;
(5) 混勻,置4℃過夜
(6) 加入硼氫化鈉溶液0.1ml,混勻,4℃放置3h;
(7) 對0.01mol/L,pH7.4 PBS,4℃透析過夜,換液3次;
(8) 3000r/min離心30min,去除沉淀物;
(9) 收集上清液即為酶標記抗體。
【注意事項】
(1) 在氧化HRP時,以pH5.6醋酸鹽緩沖液溶解酶為宜。
(2) 一般認為氧化HRP 5mg, NaIO4量以0.06mol/L 0.5ml為宜,不能低于0.015mol/L 0.5ml。
(3) 氧化HRP時間以15-30min為宜。
(4) 加入DNFB的目的是為了封閉酶蛋白中殘留的a-和e-氨基。
(5) 加入乙二醇的目的是終止反應;為便于在加入抗體后調(diào)pH值,故乙二醇要用0.05mol/L CBS配制。
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