用反義RNA分子來調(diào)節(jié)基因表達(dá)時,經(jīng)常會遇到的困難是反應(yīng)模板的穩(wěn)定性差。因此,人們正在探索如何改進(jìn)反義基因的新方法,目前主要有:
(1)優(yōu)化反義RNA的結(jié)合。反義RNA鏈的長度對抑制基因的效果是重要的。雙螺旋形成過程中將釋放能量,RNA鏈越長,釋放的自由能越多。從這一意義來講,可以說長RNA作為反義RNA更有效。但是,并沒有關(guān)于反義RNA長度的一般規(guī)則。Nellen和Lichtentein曾指出,有關(guān)反義RNA技術(shù)的一個普遍問題是,怎樣使反義RNA更有效,即怎么樣使一個互補的RNA成為有效的反義RNA。在植物中覆蓋整個cDNA的反義RNA有效地抑制了基因表達(dá)。但是,與5¹或3¹端部分mRNA互補的反義RNA效果同樣好。zui小的反義RNA只有41個核苷酸。
反義RNA的二級結(jié)構(gòu)對雙螺旋的形成至關(guān)重要。因為形成雙鏈結(jié)構(gòu)必須克服正義和反義RNA本身的二級結(jié)構(gòu),比潛在自由能的量更重要的是形成雙螺旋的作用能量,也就是說,雙螺旋構(gòu)象是由動力學(xué)控制的,而不是由釋放的自由能的量控制的。原核生物中自然發(fā)生的RNA可以很好的說明RNA結(jié)構(gòu)與形成雙螺旋構(gòu)象的速度之間的復(fù)雜關(guān)系。Simons和Kleckner指出,許多非常有效的反義RNA通常較短(約70個核苷酸),含有一個典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。例如大腸桿菌R1質(zhì)粒的拷貝數(shù)受反義 RNA cop A的控制。Nordstroem和合作者詳細(xì)研究了這一系統(tǒng),其正義和反義RNA由同一DNA編碼,但以相反方向轉(zhuǎn)錄。因此,點突變一點也不能改變這兩種RNA的互補性,但是當(dāng)同時改變正義和反義RNA環(huán)區(qū)時,雖然兩條RNA鏈*互補,但結(jié)合率下降了三至四倍。與此同時,質(zhì)粒拷貝數(shù)卻增加了。很顯然,結(jié)合率受正義和反義RNA二級結(jié)構(gòu)的影響。兩條RNA鏈形成雙螺旋的初始“吻合”結(jié)構(gòu)非常重要。
毫無疑問,內(nèi)源的正義RNA不能被改變,但反義RNA的靶結(jié)合區(qū)及反義RNA的長度是可以改變的。這將影響反義RNA的二級結(jié)構(gòu),從而改變其結(jié)合能力,使其與靶RNA結(jié)合更有效。Rittner等令人信服地證明了反義RNA的長度與它的結(jié)合率之間的復(fù)雜關(guān)系。他們用一個5¹端長度固定的人免疫缺陷型I型病毒(HIV-I)的反義RNA,改變其3¹端,從而改變了RNA長度。然后選擇能夠快速結(jié)合的反義RNA,發(fā)現(xiàn)結(jié)合率長度之間的關(guān)系依長度和相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)的不同而擺動。3¹端只有幾個核苷酸不同的反義RNA結(jié)合率變化可達(dá)上百倍。這與反義RNA的二級結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。而且,體外的結(jié)合率與體內(nèi)抑制HIV-I增值的有效性一致。這些結(jié)果也證明了在體內(nèi)應(yīng)用反義RNA抑制靶基因之前,在離體條件下實驗的重要性。
在優(yōu)化反義RNA的實際長度以前,也可以用計算機輔助分析靶RNA,以尋找有效的靶RNA序列,通過設(shè)置一個50~400核苷酸的窗口,Sczakiel等設(shè)計了基因組和非基因組HIV RNA的能量。這些能量反映了區(qū)域折疊能力。觀察到高△G值(低自由能)區(qū)域與抑制HIV復(fù)制的zui有效區(qū)相對應(yīng)。
(2)延長反義RNA的半衰期。原核生物中自然發(fā)生的反義RNA極其穩(wěn)定,可能是由于它們特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)保護(hù)它們免受核酸外切酶的降解。據(jù)報道,通過控制插入序列IS10的RNA-OUT,能在體內(nèi)穩(wěn)定存在70 min,達(dá)三代之久。在反義RNA的末端加上這些保護(hù)性的莖環(huán)結(jié)構(gòu),可以減少核酸外切酶的降解。Heinrich等應(yīng)用了這一方法。zui近,Bourque和Folk報道,一個變相方法是把反義RNA與tRNA連接,用一個依賴于DNA的RNA聚合酶III特異啟動子來表達(dá)。
(3)在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)反義RNA。另一個能夠獲得高水平表達(dá)的反義RNA的方法是在一個游離的復(fù)制系統(tǒng)中表達(dá)反義基因。這種系統(tǒng)不同于轉(zhuǎn)基因于細(xì)胞核內(nèi)染色體上。已有幾個應(yīng)用植物RNA病毒作為載體的系統(tǒng),在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)反義RNA。Joshi等用螢火蟲螢光素酶基因代替了大麥條斑病毒(BSMV)RNA β的開放讀碼框b,并且在轉(zhuǎn)染煙草和玉米原生質(zhì)體時表達(dá);Donson等用一個以TMV為基礎(chǔ)的載體來產(chǎn)生細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II)。Chapman等應(yīng)用馬鈴薯病毒X(PVX)為載體,表達(dá)了β-葡萄糖苷酸酶(GUS)。Dolja等把GUS插入到煙草蝕刻病毒(TEV)的多聚蛋白中,得到了表達(dá)。因此,在這樣的系統(tǒng)中表達(dá)反義RNA是*可行的。劉博林等借助于Chapman等的PVX載體表達(dá)系統(tǒng),在野生煙草(N. clevelandii)細(xì)胞質(zhì)中成功表達(dá)了對應(yīng)于plum pox virus(PPV)的反義RNA和酶性RNA。這為在細(xì)胞質(zhì)中抑制RNA病毒的復(fù)制研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
上海通蔚生物科技有限公司
地址:上海市金山區(qū)楓涇鎮(zhèn)環(huán)東一路65弄2號3463室
主營產(chǎn)品:ELISA檢測試劑盒,ELISA試劑盒,酶聯(lián)免疫試劑盒,人ELISA試劑盒,大鼠ELISA試劑盒,小鼠ELISA試劑盒,豚鼠ELISA試劑盒,兔ELISA試劑盒,羊ELISA試劑盒,牛ELISA試劑盒,雞ELISA試劑盒,鴨ELISA試劑盒
©2019 版權(quán)所有:上海通蔚生物科技有限公司 備案號:滬ICP備14033764號-3 總訪問量:1083085 站點地圖 技術(shù)支持:環(huán)保在線 管理登陸